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Javier Fidalgo、* Pierre-Antoine Deglesne、* Rodrigo Arroyo、* Lilian Sepúlveda、* Evgeniya Ranneva、Philippe Deprez Department of Science、Skin Tech Pharma Group、Castello D'Empúries、Catalonia、Spain * これらの著者は、この作業についていくつかの洞察を持っています。寄稿の背景: ヒアルロン酸 (HA) は、美容目的の皮膚フィラーの製造に使用される天然の多糖類です。人間の組織内での半減期は数日であるため、HA ベースの皮膚充填剤は体内での寿命を延ばすために化学的に修飾されています。市販の HA ベースのフィラーで最も一般的な変更は、HA 鎖を架橋するための架橋剤として 1,4-ブタンジオール ジグリシジル エーテル (BDDE) を使用することです。残留または未反応の BDDE は、2 ppm 未満で無毒と見なされます。したがって、患者の安全を確保するために、最終的な真皮充填剤の残留 BDDE を定量化する必要があります。材料と方法: この研究では、液体クロマトグラフィーと質量分析 (LC-MS) を組み合わせることにより、アルカリ条件下での BDDE と HA 間の架橋反応の副産物の検出と特徴付けについて説明します。結果: さまざまな分析の後、HA-BDDE ヒドロゲルを消毒するために使用されるアルカリ条件と高温が、この新しい副産物である「プロピレングリコール様」化合物の形成を促進することがわかりました。LC-MS 分析により、副生成物が BDDE と同じモノアイソトピック質量、異なる保持時間 (tR)、および異なる UV 吸光度 (λ=200 nm) モードを有することが確認されました。BDDE とは異なり、LC-MS 分析では、同じ測定条件下で、この副生成物は 200 nm での検出率が高いことが観察されました。結論: これらの結果は、この新しい化合物の構造にエポキシドがないことを示しています。商用目的の HA-BDDE ヒドロゲル (HA 真皮充填剤) の製造で見つかったこの新しい副産物のリスクを評価するために、議論は開かれています。キーワード: ヒアルロン酸、HA 皮膚フィラー、架橋ヒアルロン酸、BDDE、LC-MS 分析、BDDE 副産物。
ヒアルロン酸 (HA) に基づくフィラーは、美容目的で使用される最も一般的で人気のある皮膚フィラーです。1 この皮膚フィラーはハイドロゲルで、通常は 95% 以上の水と 0.5 ～ 3% の HA で構成されており、ゲル状の構造になっています。2 HA は多糖類であり、脊椎動物の細胞外マトリックスの主成分です。成分の一つ。(1,4)-グルクロン酸-β (1,3)-N-アセチルグルコサミン (GlcNAc) が、グリコシド結合で連結された二糖単位を繰り返しています。この二糖パターンは、すべての生物で同じです。一部のタンパク質ベースのフィラー (コラーゲンなど) と比較して、この特性により、HA は生体適合性の高い分子になります。これらのフィラーは、患者の免疫系によって認識される可能性のあるアミノ酸配列特異性を示すことができます。
真皮フィラーとして使用する場合、HA の主な制限は、ヒアルロニダーゼと呼ばれる特定の酵素ファミリーの存在による組織内での急速な代謝回転です。これまでのところ、HA 構造のいくつかの化学修飾が、組織内での HA の半減期を増加させることが報告されています。3 これらの修飾のほとんどは、HA 鎖を架橋することにより、多糖ポリマーへのヒアルロニダーゼのアクセスを減少させようとします。したがって、HA構造と架橋剤との間の架橋および分子間共有結合の形成により、架橋HAヒドロゲルは、天然HAよりも多くの抗酵素分解産物を生成します。4-6
これまでのところ、架橋HAを生成するために使用される化学架橋剤には、メタクリルアミド、7ヒドラジド、8カルボジイミド、9ジビニルスルホン、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル（BDDE）およびポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルが含まれます。10,11 BDDE は、現在最も一般的に使用されている架橋剤です。これらのタイプのヒドロゲルは数十年にわたって安全であることが証明されていますが、使用される架橋剤は反応性試薬であり、細胞毒性があり、場合によっては変異原性があります。12 したがって、最終的なハイドロゲル中のそれらの残留含有量は高くなければなりません。残留濃度が 2ppm 未満の場合、BDDE は安全であると見なされます。4
HA ヒドロゲルの低残基 BDDE 濃度、架橋度、および置換位置を検出する方法はいくつかあります。たとえば、ガスクロマトグラフィー、質量分析 (MS) と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー、核磁気共鳴 (NMR) 蛍光測定法などがあります。ダイオード アレイ結合高速液体クロマトグラフィー (HPLC)。13-17 この研究では、アルカリ条件下での BDDE と HA の反応によって生成される最終架橋 HA ヒドロゲル中の副産物の検出と特徴付けについて説明します。HPLC および液体クロマトグラフィー-質量分析 (LC-MS 分析)。BDDE のこの副産物の毒性は不明であるため、最終製品の BDDE に対して通常行われる方法と同様の方法で、残留物の定量を決定することをお勧めします。
得られた HA のナトリウム塩 (株式会社資生堂、東京、日本) の分子量は約 1,368,000 Da (ローラン法) 18 であり、固有粘度は 2.20 m3/kg です。架橋反応のために、BDDE (≥95%) は Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) から購入しました。pH 7.4 のリン酸緩衝生理食塩水は、Sigma-Aldrich Company から購入しました。LC-MS 分析で使用されるすべての溶媒、アセトニトリル、および水は、HPLC グレードの品質から購入しました。ギ酸 (98%) は試薬グレードとして購入します。
すべての実験は、UPLC Acquity システム (Waters、Milford、MA、USA) で実行され、エレクトロスプレーイオン化源 (AB SCIEX、Framingham、MA、USA) を備えた API 3000 トリプル四重極質量分析計に接続されました。
架橋 HA ヒドロゲルの合成は、1% アルカリ (水酸化ナトリウム、NaOH) の存在下で 10% (w/w) ヒアルロン酸ナトリウム (NaHA) 溶液に 198 mg の BDDE を加えることによって開始されました。反応混合物中の最終 BDDE 濃度は 9.9 mg/mL (0.049 mM) でした。次に、反応混合物を完全に混合し、均質化し、45℃で4時間進行させた。19 反応の pH は ~12 に維持されます。
その後、反応混合物を水で洗浄し、最終的なＨＡ－ＢＤＤＥヒドロゲルを濾過し、ＰＢＳ緩衝液で希釈して、１０～２５ｍｇ／ｍＬのＨＡ濃度、および７．４の最終ｐＨを達成した。生成された架橋 HA ヒドロゲルを滅菌するために、これらのヒドロゲルはすべてオートクレーブされます (120°C で 20 分間)。精製された BDDE-HA ハイドロゲルは、分析まで 4 ° C で保存されます。
架橋 HA 製品に存在する BDDE を分析するために、240 mg のサンプルを秤量し、中央の穴 (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; 容量 0.5 mL) に入れ、室温で 10,000 rpm で遠心分離しました。 10分。合計 20 μL のプルダウン液を採取して分析しました。
BDDE 標準 (Sigma-Aldrich Co) をアルカリ条件 (1%、0.1%、および 0.01% NaOH) で分析するには、次の条件が満たされている場合、液体サンプルは 1:10、1:100、または最大1:1,000,000 必要に応じて、MilliQ 脱イオン水を使用して分析します。
架橋反応に使用した出発物質 (HA 2%、H2O、1% NaOH、および 0.049 mM BDDE) については、これらの物質から調製した各サンプル 1 mL を同じ分析条件を使用して分析しました。
イオンマップに現れるピークの特異性を決定するために、100 ppb BDDE 標準溶液 (Sigma-Aldrich Co) 10 μL を 20 μL のサンプルに加えました。この場合、各サンプルの標準の最終濃度は 37 ppb です。
まず、10 μL の標準 BDDE (Sigma-Aldrich Co) を 990 μL MilliQ 水 (密度 1.1 g/mL) で希釈して、濃度 11,000 mg/L (11,000 ppm) の BDDE ストック溶液を調製します。この溶液を使用して、中間標準希釈として 110 μg/L (110 ppb) BDDE 溶液を調製します。次に、中間 BDDE 標準希釈液 (110 ppb) を使用して、中間希釈液を数回希釈して標準曲線を作成し、75、50、25、10、および 1 ppb の目的の濃度を達成します。図 1 に示すように、1.1 から 110 ppb までの BDDE 標準曲線が良好な直線性を持っていることがわかります (R2>0.99)。標準曲線は、4 つの独立した実験で繰り返されました。
図 1 LC-MS 分析で得られた BDDE 標準検量線。良好な相関が見られます (R2>0.99)。
略語: BDDE、1,4-ブタンジオール ジグリシジル エーテル。LC-MS、液体クロマトグラフィー、質量分析。
架橋ＨＡに存在するＢＤＤＥ標準およびベース溶液中のＢＤＤＥ標準を同定および定量化するために、ＬＣ－ＭＳ分析を使用した。
クロマトグラフィーによる分離は、LUNA 2.5 µm C18(2)-HST カラム (50 x 2.0 mm2; Phenomenex、米国カリフォルニア州トーランス) で行い、分析中は室温 (25°C) に保ちました。移動相は、アセトニトリル (溶媒 A) と 0.1% ギ酸を含む水 (溶媒 B) で構成されます。移動相はグラジエント溶出によって溶出されます。勾配は次のとおりです。0 分、2% A。1分、2% A;6分、98% A;7分、98% A;7.1分、2% A;10 分、2% A。実行時間は 10 分で、注入量は 20 µL です。BDDE の保持時間は約 3.48 分です (実験に基づいて 3.43 から 4.14 分の範囲)。LC-MS 分析のために、移動相を 0.25 mL/min の流速でポンプで送りました。
MS による BDDE 分析と定量化のために、UPLC システム (Waters) を、エレクトロ スプレー イオン化源を備えた API 3000 トリプル四重極質量分析計 (AB SCIEX) と組み合わせ、分析をポジティブ イオン モード (ESI+) で実行します。
BDDE で実行されたイオン フラグメント分析によると、最も強度の高いフラグメントは、129.1 Da に対応するフラグメントであると判断されました (図 6)。したがって、定量化のためのマルチ イオン モニタリング モード (MIM) では、BDDE の質量換算 (質量電荷比 [m/z]) は 203.3/129.1 Da です。また、LC-MS 分析にはフルスキャン (FS) モードとプロダクトイオンスキャン (PIS) モードを使用します。
メソッドの特異性を検証するために、ブランク サンプル (最初の移動相) を分析しました。質量換算で 203.3/129.1 Da のブランク サンプルではシグナルは検出されませんでした。実験の再現性については、55 ppb (検量線の中央) の標準注入を 10 回分析した結果、残留標準偏差 (RSD) は 5% 未満でした (データは示していません)。
残りの BDDE コンテンツは、4 つの独立した実験に対応する 8 つの異なるオートクレーブ BDDE 架橋 HA ヒドロゲルで定量化されました。「材料と方法」セクションで説明したように、定量化は BDDE 標準希釈の回帰曲線の平均値によって評価されます。時間 3.43 ～ 4.14 分 待っていません。図 2 は、10 ppb BDDE 参照標準のクロマトグラムの例を示しています。表 1 は、8 つの異なるハイドロゲルの残留 BDDE 含有量をまとめたものです。値の範囲は 1 ～ 2.46 ppb です。したがって、サンプル中の残留 BDDE 濃度は、人間の使用に許容されます (<2 ppm)。
図 2 10 ppb BDDE 参照標準 (Sigma-Aldrich Co) のイオンクロマトグラム、203.30/129.10 Da の LC-MS 分析によって得られた MS (m/z) トランジション (ポジティブ MRM モード)。
略語: BDDE、1,4-ブタンジオール ジグリシジル エーテル。LC-MS、液体クロマトグラフィーおよび質量分析;MRM、多重反応モニタリング;MS、質量。m/z、質量電荷比。
注: サンプル 1 ～ 8 は、オートクレーブ処理された BDDE 架橋 HA ヒドロゲルです。ハイドロゲル中の BDDE の残存量と BDDE 保持時間のピークも報告されています。最後に、保持時間が異なる新しいピークの存在も報告されています。
略語: BDDE、1,4-ブタンジオール ジグリシジル エーテル。HA、ヒアルロン酸;MRM、多重反応モニタリング;tR、保持時間。LC-MS、液体クロマトグラフィーおよび質量分析;RRT、相対保持時間。
驚くべきことに、LC-MS イオンクロマトグラムの分析は、分析されたすべてのオートクレーブされた架橋 HA ヒドロゲルサンプルに基づいて、2.73 ～ 3.29 分の短い保持時間に余分なピークがあることを示しました。たとえば、図 3 は架橋 HA サンプルのイオンクロマトグラムを示しており、約 2.71 分の別の保持時間に別のピークが現れています。新たに観測されたピークと BDDE からのピークとの間で観測された相対保持時間 (RRT) は 0.79 であることがわかりました (表 1)。新たに観測されたピークは、LC-MS 分析で使用される C18 カラムではあまり保持されないことがわかっているため、新しいピークは BDDE よりも極性の高い化合物に対応している可能性があります。
図 3 LC-MS によって得られた架橋 HA ヒドロゲル サンプルのイオン クロマトグラム (MRM 質量変換 203.3/129.0 Da)。
略語：HA、ヒアルロン酸。LC-MS、液体クロマトグラフィーおよび質量分析;MRM、多重反応モニタリング;RRT、相対保持時間。tR、保持時間。
観測された新しいピークが、使用した原材料に元々存在する夾雑物である可能性を排除するために、これらの原材料も同じ LC-MS 分析メソッドを使用して分析しました。分析した出発物質には、水、水中 2% NaHA、水中 1% NaOH、および架橋反応で使用したのと同じ濃度の BDDE が含まれます。使用した出発物質のイオンクロマトグラムには化合物やピークは見られず、その保持時間は観察された新しいピークに対応しています。この事実は、分析手順を妨げる可能性のある化合物または物質が出発物質に含まれている可能性があるだけでなく、他の実験室製品との交差汚染の可能性の兆候がないという考えを破棄します.BDDE の LC-MS 分析後に得られた濃度値と新しいピークを表 2 (サンプル 1 ～ 4) に、イオンクロマトグラムを図 4 に示します。
注: サンプル 1-4 は、オートクレーブ BDDE 架橋 HA ヒドロゲルの製造に使用される原材料に対応します。これらのサンプルはオートクレーブされていません。
略語: BDDE、1,4-ブタンジオール ジグリシジル エーテル。HA、ヒアルロン酸;LC-MS、液体クロマトグラフィーおよび質量分析;MRM、多重反応モニタリング。
図 4 は、HA と BDDE の架橋反応に使用される原材料のサンプルの LC-MS クロマトグラムに対応します。
注: これらはすべて、架橋反応を実行するために使用される同じ濃度と比率で測定されます。クロマトグラムで分析された原材料の番号は、(1) 水、(2) 2% HA 水溶液、(3) 1% NaOH 水溶液に対応します。LC-MS 分析は、203.30/129.10 Da の質量換算で実行されます (正の MRM モードで)。
略語: BDDE、1,4-ブタンジオール ジグリシジル エーテル。HA、ヒアルロン酸;LC-MS、液体クロマトグラフィーおよび質量分析;MRM、多重反応モニタリング。
新しいピークの形成につながった条件を調べました。架橋 HA ヒドロゲルを生成するために使用される反応条件が BDDE 架橋剤の反応性にどのように影響し、新しいピーク (副産物の可能性) の形成につながるかを調べるために、さまざまな測定が行われました。これらの決定では、最終的な BDDE 架橋剤を研究および分析しました。これは、水性媒体中のさまざまな濃度の NaOH (0%、1%、0.1%、および 0.01%) で処理された後、オートクレーブにかけられる場合とされない場合があります。同じ条件をシミュレートする細菌の手順は、架橋 HA ヒドロゲルを生成するために使用される方法と同じです。「材料と方法」セクションで説明したように、サンプルの質量遷移を LC-MS で分析して 203.30/129.10 Da にしました。BDDE と新しいピークの濃度が計算され、結果を表 3に示します。溶液中の NaOH の存在に関係なく、オートクレーブ処理されなかったサンプルでは新しいピークは検出されませんでした (サンプル 1 ～ 4、表3)。オートクレーブ処理されたサンプルの場合、新しいピークは溶液中の NaOH の存在下でのみ検出され、ピークの形成は溶液中の NaOH 濃度に依存するようです (サンプル 5-8、表 3) (RRT = 0.79)。図 5 はイオンクロマトグラムの例を示しており、NAOH の存在下または非存在下でオートクレーブ処理された 2 つのサンプルを示しています。
略語: BDDE、1,4-ブタンジオール ジグリシジル エーテル。LC-MS、液体クロマトグラフィーおよび質量分析;MRM、多重反応モニタリング。
注: 上のクロマトグラム: サンプルを 0.1% NaOH 水溶液で処理し、オートクレーブ (120°C で 20 分間) しました。下のクロマトグラム: サンプルは NaOH で処理されませんでしたが、同じ条件下でオートクレーブされました。203.30/129.10 Da (ポジティブ MRM モード) の質量変換を LC-MS で分析しました。
略語: BDDE、1,4-ブタンジオール ジグリシジル エーテル。LC-MS、液体クロマトグラフィーおよび質量分析;MRM、多重反応モニタリング。
NaOH の有無にかかわらず、オートクレーブ処理したすべてのサンプルで、BDDE 濃度が大幅に減少しました (最大 16.6 倍) (サンプル 5 ～ 8、表 2)。BDDE 濃度の低下は、高温で水が塩基 (求核試薬) として作用し、BDDE のエポキシド環を開いて 1,2-ジオール化合物を形成することが原因である可能性があります。この化合物のモノアイソトピック品質は BDDE のものとは異なるため、影響を受けません。LC-MS は、203.30/129.10 Da の質量シフトを検出しました。
最後に、これらの実験は、新しいピークの生成が BDDE、NAOH、およびオートクレーブ プロセスの存在に依存することを示していますが、HA とは何の関係もありません。
次に、約 2.71 分の保持時間で見つかった新しいピークを LC-MS で特徴付けました。この目的のために、BDDE (9.9 mg/mL) を 1% NaOH 水溶液でインキュベートし、オートクレーブしました。表 4 では、新しいピークの特性を既知の BDDE 参照ピーク (保持時間約 3.47 分) と比較しています。2 つのピークのイオン フラグメンテーション分析に基づいて、保持時間が 2.72 分のピークは BDDE ピークと同じフラグメントを示しているが、強度が異なると結論付けることができます (図 6)。2.72 分の保持時間 (PIS) に対応するピークについては、質量 147 Da でのフラグメント化後に、より強いピークが観察されました。この測定で使用された BDDE 濃度 (9.9 mg/mL) では、クロマトグラフ分離後に紫外スペクトルのさまざまな吸光度モード (UV、λ = 200 nm) も観察されました (図 7)。保持時間 2.71 分のピークは 200 nm にまだ表示されていますが、BDDE ピークは同じ条件下のクロマトグラムでは観察できません。
表 4 保持時間が約 2.71 分の新しいピークと保持時間が 3.47 分の BDDE ピークのキャラクタリゼーション結果
注: これらの結果を得るために、2 つのピークに対して LC-MS および HPLC 分析 (MRM および PIS) を実行しました。HPLC 分析には、波長 200 nm の UV 検出が使用されます。
略語: BDDE、1,4-ブタンジオール ジグリシジル エーテル。HPLC、高速液体クロマトグラフィー;LC-MS、液体クロマトグラフィーおよび質量分析;MRM、多重反応モニタリング;m/z、質量対電荷比。PIS、プロダクト イオン スキャニング。紫外線、紫外線。
注: 質量フラグメントは、LC-MS 分析 (PIS) によって取得されます。上のクロマトグラム: BDDE 標準サンプル フラグメントの質量スペクトル。下のクロマトグラム: 検出された新しいピークの質量スペクトル (BDDE ピークに関連する RRT は 0.79)。BDDE は 1% NaOH 溶液で処理し、オートクレーブしました。
略語: BDDE、1,4-ブタンジオール ジグリシジル エーテル。LC-MS、液体クロマトグラフィーおよび質量分析;MRM、多重反応モニタリング;PIS、プロダクト イオン スキャン。RRT、相対保持時間。
図 7 203.30 Da プリカーサー イオンのイオン クロマトグラム、(A) 保持時間 2.71 分の新しいピーク、および (B) 200 nm で 3.46 分の BDDE 参照標準ピークの UV 検出。
生成されたすべての架橋 HA ヒドロゲルで、LC-MS 定量化後の残留 BDDE 濃度が 2 ppm 未満であることが観察されましたが、新しい未知のピークが分析に現れました。この新しいピークは、BDDE 標準プロダクトと一致しません。BDDE標準品もポジティブMRMモードで同様の品質換算（MRM換算203.30/129.10 Da）分析を行っています。一般に、ヒドロゲル中の BDDE を検出する限界試験として、クロマトグラフィーなどの他の分析方法が使用されますが、最大検出限界 (LOD) は 2 ppm よりわずかに低くなります。一方、これまでのところ、NMR および MS は、架橋 HA 生成物の糖単位フラグメントにおける HA の架橋および/または修飾の程度を特徴付けるために使用されてきました。これらの手法の目的は、この記事で説明するような低濃度での残留 BDDE 検出を定量化することではありません (LC-MS メソッドの LOD = 10 ppb)。
投稿時間: Sep-01-2021